Inżynieria genetyczna – triumf nauki!?

Wierzycie, że osiągnięcia inżynierii genetycznej to faktycznie triumf nauki? A czy wiecie, kiedy się ona pojawiła? Tak, tak, ponad 50 lat! W nauce to lata świetlne. Właśnie, bo w tym jest problem. Ale po kolei…

W 1973 r. amerykańscy biologowie (Stanley Cohen i Herbert Boyer) jako pierwsi przenieśli ludzki gen (insuliny) do bakterii. Tak rozpoczęła się era inżynierii genetycznej – świadomej i celowej ingerencji w materiał genetyczny organizmów, w celu zmiany ich właściwości (przez pobranie i włączenie obcego DNA). Rzecz, jak się potem okazało, stosunkowo prosta u bakterii lecz bardzo skomplikowana u człowieka. Było nie było, optymizm był powszechny i nadzieje mieliśmy ogromne…Oczekiwaliśmy sukcesów w medycynie (terapia genowa i choroby zakaźne), diagnostyce molekularnej, wakcynologii, produkcji leków, rolnictwie i wielu innych dziedzinach.

Przypomnijmy sobie pokrótce najważniejsze rzeczy…

Jakie są możliwe warianty działania? Generalnie chodzi o izolację określonego genu dawcy i przekazanie go, w określonym celu, biorcy. W genetyce medycznej zwykle chodzi o ekspresję ważnych genów ludzkich w bakteriach (np. Escherichia coli). Tak uzyskuje się m.in. wspomnianą insulinę i interferony. O wiele poważniejszym wyzwaniem jest „wymiana” zmutowanego genu biorcy na jego prawidłowy allel. To jest istotą tzw. terapii genowej.

O ile sama idea jest prosta, jej realizacja w praktyce to pasmo piętrzących się trudności. Musimy bowiem rozwiązać podstawowe problemy: skąd wziąć gen (jak go uzyskać), jak go wprowadzić do organizmu biorcy i, co jest absolutnie najważniejsze, doprowadzić do jego prawidłowej ekspresji (bo to ostatecznie decyduje o skuteczności działania)?

Sam opis techniki uzyskiwania genów gotowych do przekazania biorcy to niezwykle barwna historia. Najkrócej rzecz biorąc wyszliśmy od tzw. shot-gun, w którym analizie poddawano całe DNA dawcy i dopiero potem izolowano interesujący nas gen. Potem opanowaliśmy metodę syntezy cDNA (komplementarne DNA) na matrycy mRNA z udziałem odwrotnej transkryptazy. W końcu nauczyliśmy się po prostu syntetyzować geny. Na początku wprowadzaliśmy je do innego genomu, korzystając z transformacji (plazmidy) i transdukcji (fagi) – naturalnych procesów występujących u bakterii. Potem zaczęto korzystać z mikroiniekcji polegającej na „wstrzykiwaniu” do komórek docelowych wielu kopii genu (ostatnio także, jak w przypadku „szczepionki” na kowida, samego mRNA ) upakowanych w syntetycznych nośnikach (np. nanolipidach – LNP).

I tu…nasza władza się kończy! Na ekspresję genów mamy bowiem mocno ograniczony wpływ. Przyjrzymy się bliżej terapii genowej… Jej prekursorem jest French Anderson. Istotą stosowanej strategii ma być usuwanie przyczyn choroby, a nie jej objawów. By to uzyskać trzeba do odpowiednich komórek wprowadzić prawidłowy gen, który ulegnie ekspresji. Mimo prostych założeń, poza paroma przypadkami, nie uzyskano zadowalających klinicznie rezultatów. Nieustannie pojawiają się problemy. Przypomnieć tu wypada, o czym już pisałem w kilku notkach, jak „rozmywa” nam się determinizm genetyczny. To, co zawiera się w prostym: GENY TO NIE WSZYSTKO!

Popatrzmy na kilka przykładów…

Holenderska firma uniQure otrzymała od KE pozwolenie na start pierwszej w historii terapii genowej pn. Glybera. Przeszła ona kilka niezależnych testów klinicznych, które potwierdziły jej skuteczność. Ma ona pomagać pacjentom cierpiącym z powodu rzadkiej (1-2/mln) choroby genetycznej – hiperchylomikronemii. Dotychczas jedyną terapią była dieta beztłuszczowa. Schorzenie objawia się zaburzeniami w metabolizmie chylomikronów, spowodowanymi mutacją genu odpowiedzialnego za produkcję lipazy lipoproteinowej. Może prowadzić do poważnych powikłań – chronicznego zapalenia trzustki, cukrzycy i problemów kardiologicznych. uniQure planuje też wprowadzić na rynek terapie genowe dla chorych na porfirię, hemofilię, chorobę Parkinsona i zespół Sanfilippo. Mijają lata i… https://www.uniqure.com/

Ludzie cierpiący na wrodzoną ślepotę Lebera (LCA – Leber’s congenital amaurosis) zaczynają tracić (z różnych przyczyn – etiologia jest zróżnicowana, gdyż odpowiadają za to mutacje w kilkunastu różnych genach) wzrok zaraz po urodzeniu. Uczeni z Pensylwanii zastosowali w latach 2008-2011 terapię genową u 12 osób (dorośli i dzieci), przeprowadzając zabieg na jednym oku. U 6 z nich nastąpiła znaczna poprawa. W kolejnym badaniu trzem leczonym wcześniej pacjentkom wprowadzono prawidłowe geny do drugiego oka. Poprawa nastąpiła już po 2 tygodniach. Wykazano, że także mózgi zaczęły lepiej reagować na impulsy z drogi wzrokowej (pojawiła się aktywność we wcześniej biernych obszarach kory wzrokowej).  Drugi zabieg poprawił również widzenie w oku poddanym terapii wcześniej. Mija kilka lat…i firma farmaceutyczna Spark Therapeutics ustala cenę za terapię genową pn. Luxturna. Ma ona postać jednorazowego zastrzyku do oka. Kosztuje ona 425 000$ za jedno oko, co czyni ją najdroższym lekiem kiedykolwiek sprzedawanym w USA. Ponieważ choroby oczu zwykle dotykają obie gałki, więc koszty wzrosną dwukrotnie. Niektórzy przewidują, że będą wyższe ze względu na ogromne koszty poniesione przez 25 lat badań. Szacuje się, że do terapii kwalifikuje się 2000-3000 Amerykanów. Preparat wykorzystuje zmodyfikowane cząstki wirusa z którymi wprowadza się do komórek siatkówki prawidłową kopię genu RPE65.

Naukowcy podjęli również terapię genową przeznaczoną dla pacjentów cierpiących na postać ślepoty Lebera dziedziczonej mitochondrialnie (LHON), tym razem z mutacją w genie MT-ND4. Badanie zostało przeprowadzone na 37 pacjentach. Pomimo leczenia tylko jednego oka, terapia poprawiła widzenie w obu oczach o 78%. Terapia koryguje mutację w obrębie wspomnianego genu MT-ND4. Badacze stwierdzili, że średnio po 96 tygodniach widzenie uległo poprawie. Jednakże, ku ich zaskoczeniu, w oczach, którym podano placebo, również zaobserwowano poprawę (!!!). Mechanizm pozostaje nieznany. 

Białaczkę limfoblastyczną dorosłych leczy się znacznie trudniej niż u dzieci (skuteczność 30-40% wobec 80-90%). Chorzy niepodatni na chemioterapię żyją jedynie kilka miesięcy. Uczeni z USA po raz pierwszy zmodyfikowali u. odpornościowy osób dorosłych cierpiących na ostrą białaczkę limfoblastyczną B-komórkową i doprowadzili do jej cofnięcia. Najpierw od chorych pobrali limfocyty T i przeprowadzili w nich edycję genu (wirus HIV, CRISPR). Zmodyfikowane limfocyty ponownie wprowadzili do organizmów chorych. Miały one wyszukać krążące w krwioobiegu stransformowane nowotworowo limfocyty B (zawierające białko CD-19) i je zniszczyć. U 3 chorych udało się wydłużyć remisję choroby o 5-24 m-cy. Czwarty zmarł z powodu nawrotu, a piąty – w wyniku zatoru. W kolejnych badaniach terapii poddano 63 osoby (3-25 lat), spośród których do remisji doszło u 52 (82,5%). Na tej podstawie w 2017 r. firma Novartis uzyskała akceptację FDA. Efektywność terapii jest jednak okupiona potencjalnie groźnymi działaniami ubocznymi. Zmodyfikowane limfocyty atakują bowiem także zdrowe komórki, co grozi zgonem w ciągu 4 pierwszych miesięcy terapii. Koszty wprowadzenia terapii na rynek szacuje się na 1,5 mld €.

KE zatwierdziła lek Strimvelis skierowany przeciwko rzadkiej chorobie genetycznej SCID/ADA (ciężki złożony niedobór odporności – efekt niedoboru deaminazy adenozynowej, ADA; w Europie corocznie 15 przypadków). Choroba sprawia, że pacjent jest praktycznie bezbronny wobec wirusów i bakterii, przez co musi żyć w specjalnej bańce ochronnej. Dotychczas leczono ją jedynie allogenicznymi przeszczepami szpiku kostnego (pierwsze próby terapii genowej już w 1990 r.). W leczeniu Strimvelis komórki PSC są usuwane ze szpiku kostnego pacjenta, transformowane „zdrowym” genem i ponownie wprowadzane. W USA u 18 leczonych dzieci odnotowano przeżywalność przez 2,3-13,4 lat, lecz naukowcy przestrzegają przed hurraoptymizmem. B. poważnym zagrożeniem jest (nie tylko w przypadku SCID) duże ryzyko nowotworu, na co zwracano uwagę już w 2003 r.

Rewolucyjną terapię dzieci z dystrofią mięśniową Duchenne’a (DMD) opracowali w 2014 r. francuscy naukowcy. Lek przetestowali na 18 chorych psach. Wg nich jeden zastrzyk wystarczył, by 80% włókien mięśniowych zwierząt zaczęło znacznie lepiej funkcjonować. Specyfik częściowo „naprawia” wadliwe geny, blokujące produkcję dystrofiny. Konieczne są jeszcze testy kliniczne z udziałem chorych pacjentów, zanim lek zacznie być stosowany na szeroką skalę. Na początku 2018 r. opublikowano wyniki finansowanych przez Pfizera badań, w których udowodniono skuteczność terapii genowej CRISPR/Cas-9 w leczeniu dystrofii. Dziewięciu chłopców z DMD (6-12 lat) poddano terapii z wykorzystaniem PSC. Po roku u 7 z nich odnotowano znaczną poprawę działania i siły mięśni. Opracowanie terapii zajęło naukowcom z USA ponad 30 lat. Wykorzystano w niej adenowirusy (AAV), w których genomie (jednoniciowe DNA) umieszczono gen dystrofiny. Są one niepatogenne (u. immunologiczny nie reaguje) i wykazują szczególne powinowactwo do komórek oczu i mięśni. Terapia nie jest oczywiście doskonała. Komórki mięśniowe utracone z powodu DMD nie „odrosną”, ale wydaje się, że leczenie przywraca normalną funkcję białka, które naprawia włókna mięśniowe i pomaga im rosnąć. Oznacza to, że dalsza degradacja mięśni nie powinna postępować. Nie wiadomo, czy ten sposób leczenia nie wywołuje jakichś niepożądanych skutków ubocznych w dłuższym okresie. 

Naukowcom francuskim udało się po raz pierwszy w historii pokonać anemię sierpowatą. Mimo, że jest to tylko studium przypadku z udziałem jednego francuskiego nastolatka, wyniki terapii są na tyle zachęcające, by wierzyć, że już niedługo anemia sierpowata będzie chorobą w pełni wyleczalną. Lekarze usunęli komórki macierzyste szpiku kostnego z ciała nastolatka i wprowadzili do organizmu zmodyfikowane wirusy zawierające prawidłowe geny hemoglobiny. Część erytrocytów stała się normalna i pacjent nie potrzebował transfuzji krwi już 3 miesiące po zabiegu. Jednak od tamtej pory…panuje głucha cisza!

Wykorzystując terapię genową naukowcy pokonali chorobę u 9 mężczyzn cierpiących na ciężką postać hemofilii A. Zmodyfikowali geny chorych przy pomocy adenowirusa. Po pierwszej infuzji, pacjenci wyprodukowali znacznie więcej czynnika krzepnięcia VIII niż zwykle. Stan ten utrzymywał się do 24 tygodni i przez ten czas nie mieli objawów choroby. Nie stwierdzono także żadnych efektów toksycznych ani ubocznych skutków odpornościowych. Drugi eksperyment dotyczył hemofilii B. Po odpowiedniej modyfikacji genu i wprowadzeniu go do organizmu przy pomocy wirusa AAV, u 10 uczestników eksperymentu odnotowano wzrost stężenia czynnika. W obu przypadkach, pacjenci nie wymagali konwencjonalnego leczenia przez dłuższy czas po dokonaniu infuzji.

Podsumujmy…

Jak dotychczas terapie genowe dotyczą przede wszystkim szpiku i oczu, rzadko innych tkanek, a wyjątkowo płodów i zarodków. Choroby są rzadkie lub bardzo rzadkie, a dodatkowo wiele z nich ma różnorodne podłoże (np. ślepota Lebera), co zmusza badaczy do opracowania odrębnych terapii. Osiągnięcie założonego efektu wymaga żmudnej, wieloletniej zespołowej pracy. Terapie są bardzo kosztowne i towarzyszy im wiele groźnych skutków ubocznych, z nowotworami i zgonami włącznie. Notuje się wiele niepowodzeń, nieprzewidywalna jest trwałość, brakuje długoletnich danych. I przypomnę raz jeszcze: TO JUŻ PONAD 50 LAT PRÓB!!!

Podstawowym problemem jest ograniczona kontrola nad precyzją przekazywania terapeutycznych postaci genu i ich ekspresją w komórkach docelowych. Uświadomiliśmy sobie bolesną prawdę, że inżynieria genetyczna w medycynie jest dalece bardziej skomplikowanym problemem niż w przypadku drobnoustrojów. Ingerujemy tu w niezwykle złożone mechanizmy leżące u podstaw funkcjonowania genomu ze zjawiskami epigenetycznymi włącznie. Dotkliwie przekonaliśmy się o tym w ostatnich latach, kiedy swoistą terapię genową zastosowano w epidemii (?) SARS-CoV-2.

A może to wszystko wygląda tak?

Podstawowym problemem biologii wydają się być relacje między genotypem (DNA) i fenotypem (cechy). „Wyboista droga” od genów do cech to w najogólniejszym sensie epigenetyka. Czy to może mieć wymiar metafizyczny? Stwórca obdarzył nas tajemniczym DNA (kod Boga) i dał wolną wolę (czynniki epigenetyczne;  tu: ukryty porządek, biocentryzm i rezonans morficzny?). Geny stają się wtedy jedynie kapitałem początkowym – planem, który można zrealizować na „tysiące sposobów” (światy równoległe?). Wszelkie „odstępstwa” od genetycznego determinizmu stają się w takim świetle oczywiste! Być może decydujące są tu nasze myśli (umysł ponad materią!) i ich zdolność kreowania rzeczywistości (wpływ DNA na fotony oraz myśli i emocji na DNA, który jest spoiwem Wszechświata). Czy zatem choroby cywilizacyjne są m.in. „zasługą” nowych technik (komputery, telefony komórkowe, kuchenki mikrofalowe, 5G i inne)?